Влияние сингенных мезенхимных стволовых клеток на восстановление костной ткани у крыс при имплантации деминерализованного костного матрикса

Кругляков П. В., Соколова И. Б., Зинькова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. Цитология 47[6], 466-476. 2005

ООО "Транс-Технологии", Санкт-Петербург, pitkus@alkorbio.ru

Мезенхимные стволовые клетки (МСК) – плюрипотентные клетки, резиденты стромы костного мозга. Они способны к самоподдержанию и дифференцировке в нескольких направлениях: хондрогенном, адипоцитарном, нейрональном, кардиомиоцитарном, миоцитарном. Одно из ортодоксальных направлений их дифференцировки – костное. Восстановление костной ткани с помощью МСК – современный, перспективный метод лечения сложных переломов и повреждений больших участков костей. Эксперименты проведены на крысах – самцах инбредной линии Вистар-Киото. МСК выделены из костного мозга, культивированы in vitro. Деминерализованные костные матриксы получены из теменных костей крыс и кур. Часть матриксов заселялась недифференцированными МСК. Костную ткань у экспериментальных животных повреждали в теменной области черепа. На место повреждения имплантировали полученные матриксы, заселенные МСК, или без МСК, или металлическую пластину. Показано, что заселение сингенного и ксеногенного деминерализованного костного матрикса МСК активировало ангиогенез и остеогенез в месте повреждения. Трансплантация сингенного матрикса с МСК привела к тому, что в месте повреждения сформировалась кость, по строению аналогичная утраченной. Новообразованная кость по одному краю срослась с предсуществующей костью. При использовании ксеногенного матрикса МСК был минимизирован процесс воспаления (реакция "хозяин против трансплантата"). В этом случае процессы восстановления костной ткани проходили примерно так же, как при имплантации незаселенного сингенного матрикса.

Обсуждается возможность применения аутологичных МСК в клинической практике при трансплантации деминерализованного костного матрикса.

Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, деминерализованный костный матрикс, остеоциты.

Мезенхимные стволовые клетки – плюрипотентные клетки, резиденты стромы костного мозга. Они способны к самоподдержанию и дифференцировке в нескольких направлениях: хондрогенном, адипоцитарном, нейрональном, кардиомиоцитарном, миоцитарном. In vitro было показано, что МСК могут дифференцироваться в остеоциты (Bruder et al., 1998; Pittenger et al., 1999; Jaiswal et al., 2000; Lee et al.2003). На этом основано применение МСК для восстановления костной ткани при сложных переломах и повреждениях больших участков костей. В настоящее время отрабатываются условия и технологическое обеспечение для применения МСК in vivo для восстановления поврежденной костной ткани (Bruder, Fox, 1999; Hou et al., 1999; Ohgushi, Caplan, 1999; Lee et all., 2001; Noshi et al., 2001; Boo et al., 2002; Arinzeh et al., 2003; Ohgushi et al., 2003).

Для того, чтобы получить правильную трехмерную структуру восстановленной кости, МСК должны быть нанесены на матрикс со строением, аналогичным костному. Для остеозамещения используется широкий спектр материалов как биологического происхождения (аутогенная, аллогенная, формализованная костная ткань, коллагеновые матриксы) (Ueda et al., 2001; Mardas et al., 2003; Xiao et al., 2003), так и синтетических (гидроксиапатиты, биокерамика и др.) ( Manso et al., 2002; Thalgott et al., 2002; ; Gorna, Gogolewski, 2003; Rochet et al., 2003; Tabata et al., 2003; Wang et al., 2003; Ge et al., 2004). Ко всем трансплантатам предъявляется ряд требований. Трансплантат должен полностью замещать поврежденную костную ткань и препятствовать дальнейшему увеличению объема дефекта (остеокондуктивная функция). Имплантированный материал должен инициировать образование остеоцитов в объеме повреждения (остеоиндуктивная функция) и биоинтеграцию – врастание клеток новообразующейся кости в структуру матрикса. Кроме того, трансплантат должен иметь хорошие показатели биосовместимости и достаточно быстро резорбироваться в организме реципиента. Всем этим требованиям практически идеально соответствует аутологичный деминерализованный костный матрикс, заселенный мезенхимными стволовыми клетками.

Цель данной работы - изучить влияние МСК на процессы восстановления костной ткани у крыс.

Материал и методика

Все эксперименты были проведены на крысах – самцах инбредной линии Wistar-Kyoto весом 130 – 150 г. Возраст животных – 4-5 мес.

Выделение и культивирование МСК крыс. Суспензию костного мозга выделяли из бедренных костей крыс сразу после декапитации. В стерильных условиях удаляли эпифизы бедренных костей, а диафизы промывали средой aMEM (Hyclone, Новая Зеландия), содержащей 20 % сыворотки крови эмбрионов коров (Gibco, США) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, США). Полученный смыв высевали на пластиковые чашки Петри (Sarstedt, Германия). Через 48 ч после эксплантации костного мозга проводили двукратную процедуру отмывки МСК от форменных элементов крови с помощью PBS (20 мМ фосфатный буферный раствор, pH 7,4; 0,1 M NaCl). Клетки культивировали в монослое при 37 оС в атмосфере 5 % СО2 в течение 6-7 сут после эксплантации. В дальнейшем культуру пересевали каждые 7 сут с исходной плотностью 1,27х103 кл/см2. Для пересева культуры МСК крыс использовали раствор трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия). Замену питательной среды проводили каждые 3 сут.

Фенотипирование. МСК крыс проводили на проточном цитофлюориметре FACSscan (Beckton Dickinson, США). МСК окрашивали антителами против негативного маркера CD45 (Beckton Dickinson, США) и антителами против позитивного маркера CD90 (Beckton Dickinson, США). Для окрашивания антителами против поверхностных маркеров клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия), промывали два раза PBS, затем на 1 ч переносили в раствор моноклональных антител, коньюгированных с флюорохромом, в разведении 1:20. Далее клетки промывали два раза PBS и оценивали интенсивность свечения. Фенотипирование проводили после первого, второго и третьего пересева культуры.

Дифференцировка МСК в остеогенном направлении. Направленной дифференцировке подвергались мезенхимные стволовые клетки крыс после второго пересева культуры. Для индукции дифференцировки МСК в остеогенном направлении использовали опубликованные протоколы и соответствующие коктейли ростовых факторов и морфогенов (Jaiswal et al., 1997; Pittenger et al., 1999; Rodriguez et al., 2002). МСК наращивали до плотного монослоя. Далее в стандартную среду культивирования добавляли 10-2 М b-глицерофосфата натрия, 10-8 М дексаметазона и 2х10-4 М аскорбиновой кислоты. Обработку индукторами дифференцировки продолжали 2 нед, причем половину среды культивирования меняли каждые 3 сут. Морфологические изменения после дифференцировки оценивали визуально с помощью микроскопа (Leica, Германия).

Фенотипирование полученных производных проводили с помощью анализа экспрессии маркерных генов методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ - ПЦР). Для этого выделяли тотальную РНК из дифференцированных клеток и матричную РНК ревертировали с помощью обратной транскриптазы и полиА - праймера. Полученную кДНК полимеризовали со специфическими праймерами и проводили ПЦР. Продукт реакции анализировали методом электрофореза в агарозном геле. В качестве маркера недифференцированных МСК был выбран ген фибронектина (Juneja et al., 1992), в качестве маркеров остеогенной дифференцировки – гены остеопонтина и остеокальцина (Zur Nieden et al., 2003). Для анализа экспрессии маркерных генов методом ОТ - ПЦР использовали следующие специфические праймеры (MWG-Biotech AG, Германия): для остеопонтина - for-5'-acagtcaggcgagttccaaag-3', rev-5'-tcctgtaagtttgcctgcctc -3'; для остеокальцина - for-5'-agcagacaccatgaggaccc-3', rev-5'-tcgaggcagagagagggaac-3'; для фибронектина - for-5'-ttacggtggcaactcaaacg-3', rev-5'-atcggcatcgtagttctggg-3'. Праймеры подбирали с помощью программы GeneRunner по последовательностям мРНК, опубликованным на сайте Национального института Здоровья (США)

Для дальнейшей характеристики культур МСК подтверждали их способность к дифференцировке в других ортодоксальных направлениях: хондрогенном и адипоцитарном (Кругляков и др., 2004).

Получение крысиного и куриного деминерализованного костного матрикса и заселение его МСК. При проведении серии экспериментов по восстановлению костной ткани с помощью МСК мы использовали ксеногенный (куриный) и сингенный (крысиный) деминерализованные костные матриксы. Для трансплантации применялись матриксы заселенные и не заселенные МСК.

Костные пластинки были вырезаны из теменных плоских костей куриных и крысиных черепов. Затем пластинки помещали в 0,5 М раствор соляной кислоты. Обработку HCl продолжали 3 сут, при этом раствор кислоты меняли 3 раза. Костные пластинки промывали дистиллированной водой и заливали диэтиловым эфиром на 1 – 2 ч. После этого костный матрикс 5 – 7 раз промывали водой и погружали в 70 % этиловый спирт. Затем деминерализованный костный матрикс помещали в среду культивирования МСК на 12 ч, среду меняли дважды. Суспензию МСК наносили на матрикс (2,5 млн клеток на одну костную пластину), который помещали в PBS на 48 ч. Проверили эффективность вышеизложенной методики. Для этого МСК окрасили флюорохромом РКН, затем нанесли МСК на матрикс. Через 7 сут с помощью флюоресцентного микроскопа (Axioscope (Zeiss) Германия) подтвердили, что произошло полное заселение матрикса живыми МСК (рис.1). Подготовленный стерильный костный матрикс переносили на место повреждения кости у подопытных животных. В качестве негативного контроля использовались животные, у которых место повреждения было закрыто металлической пластинкой.

Рис. 1 Деминерализованный куриный костный матрикс (км), заселенный МСК крысы (а – в) и незаселенный МСК (г – е), 5 х. а, г – визуализация флюоресцентной окраски МСК; б, д – фазовый контроль; в, е – совмещение указанных выше изображений.

Моделирование экспериментального повреждения костной ткани. Крыс наркотизировали пентобарбиталом натрия (40 мг/кг) интраперитониально. В теменной области черепа с помощью бормашины высверливали отверстие диаметром примерно 8 мм без повреждения твердой мозговой оболочки. На область повреждения накладывали трансплантат. Рану на голове ушивали.

В зависимости от примененного трансплантата животные были разделены на пять экспериментальных групп (по 10 животных в каждой), которым на место повреждения имплантировали металлическую пластинку, или куриный матрикс без МСК, или куриный матрикс, заселенный крысиными МСК, или крысиный матрикс без МСК, или крысиный матрикс, заселенный крысиными МСК. На 45, 56, 65 и 119 сут после травмы проводили визуальный осмотр места повреждения и снимали рентгенограммы черепа у 2 – 5 крыс из каждой группы. Затем животных декапитиравали и производили морфологический анализ вновь образованной на месте повреждения ткани.

Гистологический анализ. У животных непосредственно после декапитации вырезали область теменной кости, включавшей место повреждения, имплантированный матрикс и прилегающие ткани. Сегменты костной ткани фиксировали в 8 % формалине не менее 3 сут. После фиксации проводили деминерализацию костных пластинок с помощью ЭДТА. Затем препараты заливали в парафин (стандартная процедура заливки) и изготавливали срезы толщиной 7 мкм. Препараты окрашивали гематоксилин – эозином по общепринятой методике.

Результаты

Фенотипирование и дифференцировка МСК invitro.

Качественный анализ популяции культивированных in vitro МСК, выделенных из стромы костного мозга крыс, после второго пассажа показал, что она состояла из: 5 – 8 % CD45+-клеток (клеток гематопоэтического ряда) и 90 – 95 % CD90+-клеток (собственно МСК) (рис. 2). МСК способны дифференцироваться в остеогенном (рис. 3, а, б) направлении. Экспрессия маркерных генов остеопонтина и остеокальцина при дифференцировке в этом направлении усиливалась. В недифференцированных МСК мРНК фибронектина экспрессировалась на высоком уровне. Этот уровень значительно снижался при индукции дифференцировки (рис. 4, а, б).

Рис. 2 Распределение интенсивности свечения клеток, выделенных из костного мозга крыс, меченых антителами против негативного (CD90, а) и позитивного (CD45, б) маркеров МСК, полученное методом проточной цитометрии на 2 пассаже после выделения. По горизонтали – интенсивность свечения клеток, экспрессирующих CD90 (а) или CD45 (б), окрашенных антителами, конъюгированными с PE и FITC соответственно; по вертикали – число клеток. Пик 1 – неокрашенные клетки (контроль), пик 2 – окрашенные клетки.

Рис. 3 Дифференцировка крысиных МСК in vitro в остеогенном направлении, фазовый контраст. 10х. а – выселение недифференцированных МСК из островка костного мозга (ОК); б – неокрашенная культура МСК, дифференцированных в остеогенном направлении. Отложившийся на чашке Петри минеральный компонент (черные стрелки), клеточные элементы (белые стрелки).

Рис. 4 Анализ экспрессии маркерных генов в недифференцированных МСК крысы (а) и МСК, подвергнутых дифференцировке в остеогенном направлении (б). 1 – недифференцированные МСК; 2 – остеогенная дифференцировка; 3 – вода.

Репарация костной ткани у крыс при трансплантации металлической пластины (негативный контроль). К 45 сут после трансплантации место повреждения было заполнено соединительной тканью, в которой присутствовали клетки воспаления – лейкоциты, макрофаги. Через 56 и 65 сут место повреждения также было заполнено исключительно соединительной тканью, но без признаков воспалительной реакции. Активация остеогенеза наблюдалась только на костной крошке и мелких обломках и по краю поврежденной кости. В самой соединительной ткани не было выявлено признаков минерализации и остеогенеза. Через 119 сут в месте повреждения сформировалась плотная соединительная ткань с небольшим количеством сосудов. Остеогенез продолжался только в зонах скопления костных обломков и крошки (рис. 5).

Рис. 5 Репарация костной ткани у крыс при трансплантации в место повреждения металлической пластины через 65 (а) и 119 сут (б) после операции; гематоксилин-эозин. 10х. а – в месте повреждения соединительная ткань (ст) без признаков воспалительной реакции; б – в месте повреждения (ст) с небольшим количеством сосудов(стрелки). К – кость реципиента.

На рентгенограммах у животных из группы отрицательного контроля через 45 – 119 сут место повреждения просматривалось очень хорошо. Видно, что покрывающая его пленка имеет совершенно иную структуру, чем предсуществующая кость (рис. 6, а).

Репарация костной ткани у крыс при трансплантации ксеногенного (куриного) матрикса. К 45 сут после трансплантации в месте повреждения наблюдали мощное лейкоцитарное воспаление (рис. 7, а). Структура ксеногенного матрикса еще была сохранена, но уже начиналась его резорбция. Вновь образованных клеток костной ткани в имплантате не выявили. К 56 сут матрикс уже не имел пластинчатого строения. Между балками наблюдали большие пространства, заполненные соединительной тканью. Клеток, подобных остеоцитам, в лакунах матрикса не обнаружили. Соединительная ткань в межбалочном пространстве была хорошо васкуляризирована, но признаков ее минерализации не было. К 65 сут куриный матрикс подвергся существенной резорбции. На его месте образовалась рыхлая соединительная ткань с некоторым количеством балок. В соединительной ткани было обнаружено много сосудов. Мы не наблюдали минерализацию оставшегося матрикса и заселение лакун остеогенными клетками (рис. 8, а). К 119 сут ксеногенный матрикс был практически полностью резорбирован. В промежутках между небольшими сохранившимися участками матрикса сформировалась плотная соединительная ткань. Капилляры наблюдали только в соединительной ткани. Незначительное количество лакун было заселено остеоцитами (рис. 8, б).

Рис. 6 Рентгенограммы черепа крыс через 119 сут после трансплантации металлической пластины (а), куриного матрикса (б), куриного матрикса, заселенного МСК крысы (в), крысиного матрикса (г), крысиного матрикса, заселенного сингенными МСК (д). Боковая проекция; стрелками указана граница между трансплантатом и костью реципиента.

На рентгенограммах и гистологических препаратах видно, что за 119 сут не происходило срастания трансплантата с предсуществующей костью. Материал, покрывший место повреждения, по плотности отличался от интактной кости (рис. 6, б).

Рис. 7. Воспаление через 45 сут в месте повреждения кости у крыс при трансплантации куриного матрикса (а), куриного матрикса, заселенного крысиными МСК (б), крысиного матрикса (в), крысиного матрикса, заселенного сингенными МСК (г); гематоксилин-эозин. 10х. а – мощная воспалительная реакция, большое количество лейкоцитов и макрофагов (стрелки), б – воспаление практически отсутствует, в – незначительное краевое воспаление, немного лейкоцитов и макрофагов (стрелки), г – воспаления нет. м – матрикс, ст – соединительная ткань, к – кость реципиента.

Репарация костной ткани у крыс при трансплантации ксеногенного (куриного) матрикса, заселенного МСК. К 45 сут в месте повреждения практически отсутствовало воспаление (рис. 7, б). Ксеногенный матрикс, заселенный аутологичными МСК, был менее резорбирован, чем незаселенный. В лакунах наблюдали клетки, по морфологии похожие на остеоциты. Было выявлено большое количество сосудов в соединительной ткани между сохранившимися балками. К 56 сут начиналась резорбция матрикса: пластинчатое строение было нарушено, увеличилось пространство между балками, заполненное соединительной тканью. В соединительной ткани наблюдали большое количество сосудов и участки минерализации. В течение 65 сут в трансплантированном матриксе сохранялись балки. Межбалочное пространство было заполнено соединительной тканью с большим количеством сосудов. На поверхности балок наблюдали клетки, похожие на остеоциты. Была выявлена слабая минерализация матрикса (рис. 8, в). К 119 сут ксеногенный матрикс, заселенный МСК, был резорбирован в гораздо меньшей степени, чем незаселенный куриный матрикс. Однако пластинчатое строение трансплантата уже отсутствовало. Свободное от матрикса место было занято рыхлой соединительной тканью с большим количеством сосудов. В сохранившихся лакунах было обнаружено немного остеоцитов. Матрикс был слабо минерализирован (рис. 8, г).

Рис. 8. Репарация костной ткани у крыс через 65 (а, в) и 119 сут (б, г) после трансплантации в место повреждения ксеногенного (куриного) матрикса (а, б) и куриного матрикса, заселенного крысиными МСК (в,г); гематоксилин-эозин. 10х. м – матрикс, ст – соединительная ткань, стрелками указаны капилляры.

В течение 65 сут место повреждения на рентгенограммах хорошо определялось: оно было покрыто менее рентгеноплотной тканью, чем кость. Через 119 сут трансплантат было уже трудно визуально отличить от интактной кости (рис. 6, в). На всех сроках исследования не было выявлено срастания трансплантата с предсуществующей костью.

Репарация костной ткани у крыс при трансплантации сингенного (крысиного) матрикса. К 45 сут в месте повреждения наблюдали незначительное краевое воспаление, в некоторых случаях - абсцесс (рис. 7, в). Матрикс практически сохранял свое пластинчатое строение. Не наблюдали заселения лакун и поверхности балок остеоцитами и сосудообразования в трансплантате. В течение 56 сут резорбция крысиного матрикса была значительно меньше, чем куриного. Он сохранял свое пластинчатое строение. В матриксе не обнаружили ни остеоцитов, ни сосудов. Выявили слабую минерализацию трансплантата. К 65 сут резорбция сингенного матрикса была незначительная. По краям трансплантата начиналось заселение лакун остеоцитами и васкуляризация. Матрикс был минерализирован в достаточной степени (рис. 9, а). В течение 119 сут матрикс сохранял свою структуру. В лакунах были обнаружены остеоциты. Трансплантат был хорошо васкуляризирован – сосуды были обнаружены в соединительной ткани как в краевых зонах, так и в межбалочном пространстве (рис. 9, б).

Рис. 9 Репарация костной ткани у крыс через 65 (а, в) и 119 сут (б, г, д, е) после трансплантации в место повреждения сингенного (крысиного) матрикса (а, б, д) и крысиного матрикса, заселенного крысиными МСК (в, г, е); гематоксилин-эозин. 10х. д, е – места стыка трансплантата с костью реципиента(к). м – матрикс, ст – соединительная ткань, стрелками указаны капилляры.

Место повреждения на рентгенограммах было видно в течение 65 сут. К 119 сут трансплантат по структуре был практически не отличим от кости, но места соединения определялись очень хорошо (рис.6, г). В течение 119 сут не произошло срастания трансплантата с предсуществующей костью.

Репарация костной ткани у крыс при трансплантации сингенного (крысиного) матрикса, заселенного МСК. К 45 сут после трансплантации в зоне повреждения не было обнаружено воспаления (рис.7, г). Крысиный матрикс, заселенный МСК, сохранял свою структуру в большей степени, чем все перечисленные выше трансплантаты. В лакунах наблюдали большое количество остеоцитов. В течение 56 сут практически не наблюдали резорбции матрикса. В лакунах были обнаружены остеоциты. И соединительная ткань, и сам матрикс были хорошо васкуляризированы. Трансплантат был минерализован больше, чем во всех описанных выше экспериментальных группах. К 65 сут матрикс был резорбирован незначительно. В лакунах наблюдали большое количество остеоцитов. Трансплантат был хорошо минерализирован и васкуляризирован (рис. 9, в). К 119 сут трансплантат имел строение, характерное для плоской кости. В лакунах было выявлено большое количество остеоцитов. Матрикс был хорошо васкуляризирован (сосуды были обнаружены в межбалочном пространстве). Прошла минерализация трансплантата. Матрикс сросся с предсуществующей костью (рис. 9, г), по крайней мере с одной стороны.

В течение 56 сут место повреждения на рентгенограммах видно очень хорошо. Через 65 сут оно уже покрыто рентгеноплотной тканью, но места соединения трансплантата с костью были хорошо заметны. Через 119 сут место повреждения уже не определялось (рис.6, д).

Обсуждение

Аллогенные костные трансплантаты на основе деминерализованных костных матриксов широко применяются при лечении обширных повреждений костной ткани (Верзен, 1993; Mess et al., 1995; Литвинов, 1996; Болтрукевич и др., 2001; Омельяненко и др., 2001; Babbush, 2003; Harris, 2004; Traianedes et al., 2004). Эта методика репарации костной ткани хорошо зарекомендовала себя в клинике, и нет необходимости подтверждать ее эффективность в экспериментах на животных. Основная цель врачей – ускорить процесс восстановления структуры костной ткани во всем объеме повреждения и добиться полного сращения трансплантата с предсуществующей костью. Для этого предлагается наносить на используемые матриксы факторы, которые активируют остеогенез в месте повреждения (Linkhart et al., 1996; Cheng et al., 2003; Diefenderfer et al., 2003; Blum et al., 2004).

В нашу задачу входило показать, как влияют МСК, нанесенные на матрикс, на восстановление костной ткани. С этой целью мы выбрали наиболее простую для исполнения модель повреждения кости у животного – удаление части плоской кости в теменной области черепа. Такое повреждение у человека встречается значительно реже, чем переломы трубчатых костей конечностей. Но именно такая простая модель позволяла избежать трудностей, связанных с фиксацией поврежденной лапы, и сохранить трансплантат практически неподвижным. Последнее условие особенно важно для правильного формирования новой костной ткани (Михайлов, 2001).

В двух сериях экспериментов нашей работы мы использовали сингенный костный матрикс. Его введение в место повреждения не вызывало иммунной реакции в организме. Однако в течение 45 сут после операции мы наблюдали незначительное воспаление по краям трансплантата (вероятно, вызванное оперативным вмешательством). С течением времени матрикс резорбировался, но его структура служила основой для формирования новой кости: трансплантат постепенно минерализовался, в межбалочных пространствах шел ангиогенез, лакуны заселялись остеоцитами, а в околобалочном пространстве формировались поля скопления клеток – предшественников костной ткани.

Заселение сингенного деминерализованного костного матрикса МСК перед трансплантацией в место повреждения приводило к существенному изменению в процессе репарации костной ткани. Мы не наблюдали реакции воспаления при имплантации такого матрикса (рис. 7, в, г). Его резорбция в организме проходила гораздо медленнее. Так, через 119 сут после трансплантации сингенный матрикс с МСК в значительной мере сохранял свою структуру. Как оценивать полученные результаты? Достаточно быстрая разборка трансплантата – условие, которое предъявляется ко всем имплантатам на основе биополимеров. Одновременно должны протекать два процесса: резорбция матрикса и замещение его новой костной тканью. Но при этом под трансплантатом подразумевается, например, костный деминерализованный матрикс, т. е., по сути, мертвая ткань. Такой матрикс необходим как каркас, на который мигрируют клетки самого организма, и активируется остеогенез. Не предполагается, что сам матрикс может встраиваться в предсуществующую кость и полностью восстановить свой метаболизм.

В нашей работе мы имели дело с качественно другим трансплантатом. Во-первых, МСК активировали ангиогенез в имплантированном костном матриксе. Наличие достаточного количества функционирующих сосудов позволяло снабжать сам матрикс и имеющиеся на нем клетки кислородом и необходимыми метаболитами. Во-вторых, МСК могли дифференцироваться в остеоциты и (или) активировать собственные остеогенные клетки организма. При этом нарастание костной ткани происходило в несколько раз быстрее, чем на незаселенном матриксе. Мы полагаем, что на основе деминерализованного сингенного матрикса, заселенного МСК, мы получили принципиально новую структуру, которая встраивалась в предсуществующую кость и имела возможность полноценно функционировать.

В этом случае остеоциты очень активно заселяли лакуны матрикса, примерно в 2 раза быстрее, чем при использовании такого же матрикса, но без МСК. Так, клетки подобные остеоцитам, были обнаружены в матриксе, заселенном МСК, через 45 сут после трансплантации, а через 65 сут мы выявляли в имплантате большое количество остеоцитов. На незаселенном сингенном матриксе достаточное количество клеток вновь образующейся кости наблюдали не ранее, чем через 119 сут. Параллельно проходила васкуляризация самого трансплантата. На 56 сут были выявлены сосуды в межбалочном пространстве, а в незаселенном трансплантате сосуды были обнаружены через 65 сут и только в краевых зонах.

Через 119 сут сингенный матрикс, заселенный МСК, в отличие от незаселенного, имел характерное для плоской кости строение (рис. 9, б, г) и на рентгенограмме по плотности не отличался от предсуществующей кости (рис. 6, д). Наиболее важен тот факт, что применение МСК способствовало полному сращению вновь образованной и предсуществующей костей (рис. 9, г, е). Применение сингенного матрикса без МСК не привело к сращению костей за этот срок (рис. 9, в, д).

Значительное влияние МСК проявилось при трансплантации ксеногенного матрикса. Введение незаселенного ксеногенного матрикса вызывало реакцию организма "хозяин против трансплантата". В месте повреждения костной ткани наблюдали мощное лейкоцитарное воспаление, чего не было в случае применения ксеногенного матрикса, заселенного аутологичными МСК (рис. 7, а, б). Вероятно, МСК в несколько раз ускоряли протекание процессов воспаления в зоне повреждения. Подобный эффект мы наблюдали в экспериментах по репарации сердечной мышцы с помощью МСК у крыс после инфаркта миокарда (Кругляков и др., 2004). Наше предположение о том, что МСК принимают участие в регуляции процессов воспаления, основывалось на следующих экспериментальных данных. Показано, что МСК in vitro секретировали интерлейкины (IL) 6, 7, 8, 11, 12, 14,15, TGF-b (Mareschi et al, 2001), факторы LIF (leukemia inhibitory factor), GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor), SCF (stem cell factor) (Majumdar et al., 1998), BDNF (brain-derived neurotrophic factor) и NGF (neuronal growth factor) (Li et al., 2002). Продукция некоторых из этих факторов (IL 6, 8, 11, GM-CSF, LIF) усиливалась при добавлении в среду культивирования такого провоспалительного цитокина, как IL-1a (Majumdar et al., 1998). Большинство из перечисленных выше факторов представляют собой медиаторы и регуляторы воспаления (Абелев, 1996). Мы полагаем, что МСК секретируют эти вещества не только in vitro, но и при попадании в место повреждения ткани in vivo.

Нанесение МСК на ксеногенный матрикc приводило к заметному замедлению резорбции трансплантата. Так, через 119 сут после пересадки крысам куриный матрикc был практически полностью разобран, тогда как такой же имплантат, но заселенный МСК, сохранял свою структуру. По степени васкуляризации и количеству остеоцитов в трансплантате ксеногенный матрикс, заселенный МСК, был очень близок к сингенному матриксу без МСК.

Итак, в представленной работе мы показали, что заселение деминерализованного сингенного матрикса МСК приводило к качественному улучшению вновь образованной ткани - в месте повреждения формировалась полноценная кость, соответствующая по структуре утраченному фрагменту. При этом была инициирована биоинтеграция – имплантат сросся с предсуществующей костью. Использование МСК примерно в два раза ускоряло процесс восстановления костной ткани в месте повреждения. Кроме того, применение МСК при трансплантации ксеногенного матрикса приводило к подавлению реакции отторжения чужеродного материала, активации ангиогенеза и остеогенеза в месте повреждения. Мы полагаем, что использование МСК может значительно ускорить процесс полного качественного восстановления кости при применении аутологичного деминерализованного костного матрикса. Заселение аллогенных или ксеногенных (в исключительных случаях) матриксов аутологичными МСК дает возможность применять такие трансплантаты для пациентов. Это направление требует дальнейшей экспериментальной и клинической разработки.

Авторы выражают глубокую благодарность Маркычеву А. Б., Гагинской Е. Р., Щепкиной Е. А., Урбанскому А. И. за предоставленную возможность использования технической базы и помощь в обсуждении полученных результатов.

Список литературы

  1. Абелев Г. И. 1996. Воспаление. Соросовский образовательный журнал. 10: 28-32.
  2. Болтукевич С. И., Калугин А.В., Богданович И. П., Замилацкий А. А., Иванцов В. А., Першукевич А. В., Першукевич В. Д. 2001. Деминерализованный костный матрикс в реконструктивно–восстановительной хирургии опорно–двигательной системы. Гродно, Гродненский ГМУ. 10с.
  3. Верзен Р. 1993. Подготовка деминерализованного костного матрикса к клиническому использованию. В кн.: Деминерализованный костной трансплантат и его применение. СПб., НИИТиО им. Р.Р. Вредена: 4-11.
  4. Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева Х. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. В., Зарицкий А. Ю., Семернин Е. Н., Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. 2004. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток. Цитология. 46 (12): 1043-1055.
  5. Литвинов С. Д. 1996. Моделирование костной ткани. В кн.: Деминерализованные костные трансплантаты и их использование в восстановительной хирургии. СПб., НИИТиО им. Р.Р. Вредена: 83-88.
  6. Михайлов В. В. 2001. Основы патологической физиологии. М.: Медицина. 703с.
  7. Омельяненко Н. П., Карпов И. Н., Матвейчук И. В., Дорохин А. И. 2001. Использование деминерализованного костного матрикса для восстановления поврежденных длинных костей со значительными дефектами. Вестник травматологии и ортопедии им. Н. Н. Пирогова. 1:53-57.
  8. Arinzeh T.L., Peter S.J., Archambault M.P., Bos C., Gordon S., Kraus K., Smith A., Kadiyala S. 2003. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical – sized canine segmental defect. J. Bone Joint. Surg. Am. 85:1927-1935.
  9. Babbush C.A. 2003. Histologic evaluation of human biopsies after dental augmentation with a demineralized bone matrix putty. Implant. Dent. 12:325-332.
  10. Blum B., Moseley J., Miller L., Richelsoph K., Haggard W. 2004. Measurement of bone morphogenetic proteins and other growth factors in demineralized bone matrix. Orthopedics. 27:161-165.
  11. Boo J.S., Yamada Y., Okazaki Y., Hibino Y., Okada K., Hata K., Yoshikawa T., Sugiura Y., Ueda M. 2002. Tissue – engineered bone using mesenchymal stem cells and a biodegradable scaffold. J. Craniofac. Surg. 13:231-239.
  12. Bruder S., Fox B. 1999. Tissue engineering of bone: cell based strategies. Clinical Orthopaedics and Related Research. 1:S68-S83.
  13. Bruder S., Ricalton N., Boynton R., Connolly T., Jaiswal N., Zaia J., Barry F. 1998. Mesenchymal stem cell surface antigen SB – 10 corresponds to activated leukocyte cell adhesion molecule and is involved in osteogenic differentiation. J. Bone and Mineral Research. 13:655-663.
  14. Cheng H., Jiang W., Phillips F.M., Haydon R.C., Peng Y., Zhou L., Luu H.H., An N., Breyer B., Vanichakarn P., Szatkowski J.P., Park I.Y., He T.C. 2003. Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenetic proteins (BMPs). J. Bone Joint Surg. Am. 85A:1544-1552.
  15. Diefenderfer D.L., Osyczka A.M., Reilly G.C., Leboy P.S. 2003. BMP responsiveness in human mesenchymal stem cells. Connect Tissue Res. 44:305-311.
  16. Ge Z., Baguenard S., Lim L.Y., Wee A., Khor E. 2004. Hydroxyapatite – chitin materials as potential tissue engineered bone substitutes. Biomaterials. 25:1049-1058.
  17. Gorna K., Gogolewski S. 2003. Preparation, degradation, and calcification of biodegradable polyurethane foam for bone graft substitutes. J. Biomed. Mater. Res. 67A:813-827.
  18. Harris R.J. 2004. Clinical evaluation of a composite bone graft with a calcium sulfate barrier. J. Periodontol. 75:685-692.
  19. Hou Z., Nguyen Q., Frenkel B., Nilsson S.K., Milne M., Wijnen A., Stein J.L., Quesenberry P., Lian J.B., Stein G. 1999. Osteoblast – specific gene expression after transplantation of marrow cells: implications for skeletal gene therapy. Cell Biology. 96:7294-7299.
  20. Jaiswal N., Haynesworth S.E., Caplan A.I., Bruder S.P. 1997. Osteogenic differentiation of purified, culture – expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J. Cell Biochem. 64:295-312.
  21. Jaiswal R., Jaiswal N., Bruder S., Mbalaviele G., Marshak D., Pittenger M. 2000. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J. Biol. Chem. 275:9645-9652.
  22. Juneja H.S., Schmalsteig F.C., Rajaraman S., Hanson E.M., Lee S., Brasher W. 1992. Heterotypic adherence between murine leukemia/lymphoma cells and marrow stromal cells involves a recognition mechanism with galactosyl and mannosyl specificities. Exp. Hematol. 20:405-11.
  23. Lee H.S., Huang G.T., Chiang H., Chiou L.L., Chen M.H., Hsieh C.H., Jiang C.C. 2003. Multipotential mesenchymal stem cells femoral bone marrow near the site of osteonecrosis. Stem Cells. 21:190-199.
  24. Lee K., Majumdar M.K., Buyaner D., Hendricks J.K., Pittenger M.F., Mosca J.D. 2001. Human mesenchymal stem cells maintain transgene expression during expansion and differentiation. Mol. Therapy. 3:857-866.
  25. Li J., Yu X., Pan W., Unger R.H. 2002. Gene expression profile of rat adipose tissue at the onset of high-fat-diet obesity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 282:E1334-41.
  26. Linkhart T.A., Mohan S., Baylink D.J. 1996. Growth factors for bone growth and repair: IGF, TGF beta and BMP. Bone. 19:1S-12S.
  27. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D., Moorman M., Gerson S.L. 1998. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. J. Cell Physiol. 176:57-66.
  28. Manso M., Ogueta S., Herrero-Fernandez P., Vazquez L., Langlet M., Garcia-Ruiz J.P. 2002. Biological evaluation of aerosol – gel – derived hydroxyapatite coatings with human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 23:3985-3990.
  29. Mardas N., Kostopoulos L., Stravropoulos A., Karring T. 2003. Evaluation of cell – permeable barrier for guided tissue regeneration combined with demineralized bone matrix. Clin. Oral. Impl. Res. 14:812-818.
  30. Mareschi K., Biasin E., Piacibello W., Aglietta M., Madon E., Fayioli F. 2001. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86:1099-1100.
  31. MessS.D., Joganic E., Manwaring K.H., Beals S.P. 1995. Transplanted deminiralized bone graft in cranial reconstructive surgery. Pediatr. Neurosurg. 23:199-205.
  32. Noshi T., Yoshikawa T., Dohi Y., Ikeuchi M., Horiuchi K., Ichijima K., Sugimura M., Yonemasu K., Ohgushi H. 2001. Recombinant human bone morphogenetic protein – 2 potentiates the in vivo osteogenic ability of marrow/hydroxyapatite composites. Artificial Organs. 25:201-208.
  33. Ohgushi H., Caplan A.I. 1999. Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering. J. Biomed. Mater. Res. 48:913-927.
  34. Ohgushi H., Miyake J., Tateishi T. 2003. Mesenchymal stem cells and bioceramics: strategies to regenerate the skeleton. Novartis Found Symp. 249:118-127.
  35. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284:143-147.
  36. Rochet N., Loubat A., Laugier J.P., Hofman P., Bouler J.M., Daculsi G., Carle G.F., Rossi B. 2003. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32:602-610.
  37. Tabata M., Shimoda T., Sugihara K., Ogomi D., Serizawa T., Akashi M. 2003. Osteoconductive and hemostatic properties of apatite formed on/in agarose gel as bone – grafting material. J. Biomed. Mater. Res. 67B:680-688.
  38. Thalgott J.S., Giuffre J.M., Klezl Z., Timlin M. 2002. Anterior lumbar interbody fusion with titanium mesh cages, coralline hydroxyapatite, and demineralized bone matrix as part of a circumferential fusion. Spine J. 2:63-69.
  39. Traianedes K., Russell J.L., Edwards J.T., Stubbs H.A., Shanahan I.R., Knaack D. 2004. Donor age and gender effects on osteoinductivity of demineralized bone matrix. J. Biomed. Mater Res. 70B:21-29.
  40. Ueda M., TohnaiI., Nakai H. 2001. Tissue engineering research in oral implant surgery. Artif. Organs. 25:164-171.
  41. Wang Y., Uemura T., Dong J., Kojima H., Tanaka J., Tateishi T. 2003. Application of perfusion culture system improves in vitro and in vivo osteogenesis of bone marrow – derived osteoblastic cells in porous ceramic materials. Tissue Eng. 9:1205-1214.
  42. Xiao Y., Qian H., Young W., Bartold P. 2003. Tissue engineering for bone regeneration using differentiated alveolar bone cells in collagen scaffolds. Tissue Engineering. 9:1167-1177.

    Zur Nieden N.I., Kempka G., Ahr H.J. 2003. In vitro differentiation of embryonic stem cells into mineralized osteoblasts. Differentiation. 71:18-27.